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·PCR
 
 
 





DNA非变性PAGE电泳试剂盒
 产品货号: RTE4101
 产品名称: DNA非变性PAGE电泳试剂盒
 产品价格/规格: 100次 450元
 产品说明书: 点击查看
 更新时间: 2019-10-18
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  •   DNA非变性PAGE电泳试剂盒(货号RTE4101   Ver.690775

    DNA Native PAGE Electrophoresis Kit

    产品组成:

    货号

    名称

    规格

    保存条件

    AC2913-02

    30%PAA(29:1)

    500 ml

    4

    TB001

    5×TBE

    500 ml

    RT

    AP020P

    APS(干粉)

    0.5 g

    RT配制后-20贮存

    TA0761-01

    TEMED

    0.5 ml

    4,避光

    DL070

    6×Native-PAGE DNA上样缓冲液

    1 ml

    4

    产品简介:

    非变性 PAGE 电泳是研究DNA构象变化的常用手段,在非变性条件下DNA的泳动与电荷、片段大小、DNA结合的蛋白及折叠构象都有关系。非变性PAGE电泳是研究单链 PCR片段构象多态性(SSCP-PCR,single-strand conformation  polymorphism-PCR)的重要研究手段。在SSCP测定中,双链DNA(dsDNA)变性为单链DNA(ssDNA),每一条单链DNA都基于他们的内部序列呈?#26893;?#21516;的折叠构象,即使相同长度的单链DNA因其碱基顺序不同,甚至单个碱基的不同都会形成不同的构象。这些不同构象的ssDNA 在非变性PAGE中得到分离。

    本公司提供的DNA非变性PAGE电泳试剂盒包含凝胶制备及电泳所需的全部试剂,用户只需自备制胶器具和蒸馏水,?#32431;?#37197;制各种浓度的PAGE胶,使用方便。

    按照每次制备100 ml 12%凝胶计算,试剂盒可配制10-12块非变性PAGE胶?#35805;?#29031;每次制备8 ml 12%凝胶计算,试剂盒可配制至少100块非变性PAGE胶。

    贮存和效期:

       本产品常温运输,按照标签温度贮存;有效期一年。

    使用说明:

    一、制备凝胶步骤:

    10% APS配制-5 ml

    将0.5 gAPS干粉溶于5 ml灭菌水中,彻底溶解后分装,1 ml/支,-20℃备存,每次取一管使用。10% APS应尽量减少室温存放时间,以防失效。10%APS在4℃有效期为一周,-20℃有效期6个?#38534;?#33509;发现凝胶聚合时间延长,应考虑更换使用-20度保存的10% APS。

    1.参照凝胶模具说明书,装配好凝胶模具。

    2.根据表一和表二,将不同体积的成分在适?#27604;?#22120;中混合。

    表一 配制不同浓度凝?#26680;?#38656;各组分的体积(总体积100 ml,适用于大板胶)

    各组份体积(ml

    最佳DNA分离?#27573;?/span>

    凝胶浓度

    灭菌水

    30%PAA291

    5×TBE

    10%APS

    TEMED

    总体积

    80-500 bp

    5%

    63.3

    16.7

    20

    0.8-1

    0.1

    100 ml

    70-450 bp

    6%

    60

    20

    20

    0.8-1

    0.1

    100 ml

    60-460 bp

    8%

    53.3

    26.7

    20

    0.8-1

    0.1

    100 ml

    50-300 bp

    10%

    46.7

    33.3

    20

    0.5-0.8

    0.1

    100 ml

    40-200 bp

    12%

    40

    40

    20

    0.5-0.8

    0.1

    100 ml

    25-150 bp

    15%

    30

    50

    20

    0.5

    0.1

    100 ml

    5-100 bp

    20%

    13.3

    66.7

    20

    0.5

    0.1

    100 ml

    表二 配制不同浓度凝?#26680;?#38656;各组分的体积(总体积8 ml,适用于小板胶)

    各组份体积(ml

    最佳DNA分离?#27573;?/span>

    凝胶浓度

    灭菌水

    30%PAA291

    5×TBE

    10%APS

    TEMED

    总体积

    80-500 bp

    5%

    5.07

    1.33

    1.6

    0.08

    0.008

    8 ml

    70-450 bp

    6%

    4.8

    1.6

    1.6

    0.08

    0.008

    8 ml

    60-460 bp

    8%

    4.27

    2.13

    1.6

    0.08

    0.008

    8 ml

    50-300 bp

    10%

    3.73

    2.67

    1.6

    0.08

    0.008

    8 ml

    40-200 bp

    12%

    3.2

    3.2

    1.6

    0.05

    0.008

    8 ml

    25-150 bp

    15%

    2.4

    4

    1.6

    0.05

    0.008

    8 ml

    5-100 bp

    20%

    1.07

    5.33

    1.6

    0.05

    0.008

    8 ml

    注: = 1 \* GB3 有大量文献报道PAGE胶中加入5%-10%?#27597;?#27833;能提高某些位点的分辨率。如果选择加入10%?#27597;?#27833;,则相应减少去离子水的用量。

    = 2 \* GB3 凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度?#32454;?#26102;,聚合较快;冬天气温低时,聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。

    3.在凝胶模具中灌入适量凝胶溶液,在胶的液面距离达到顶部时停?#26500;?#33014;,插入梳?#21360;?

    4.常温静置30-60分钟,

    注:凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度?#32454;?#26102;,聚合较快;冬天气温低时,聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。

    5. 拔出梳子,用1×TBE液冲洗加样孔。

    6.4冰箱预冷30分钟或过夜预冷。为了防止胶收缩,最好顶部加少量1×TBE缓冲液。预冷的胶有利于保持单链DNA的构型。

    二、电泳:

    7.  将预冷的凝胶板固定在电泳装置上,往上槽和下槽中加入足够1×TBE电泳液。

    8.  取 5-10 μl SSCP-PCR样品,加入相应体积6×Native PAGE DNA上样液,85℃5分钟后冰浴,短暂离心后取2-5 μl上样。

    9.  连接电源线,打开电源开关。按照5V/cm 电压电泳。由于温度变化过大会改变 DNA 构型,所以电泳时最好能保持恒?#38534;?#23545;?#32531;?#29976;油的PAGE,最好恒温在4℃,对含甘油的PAGE,最好恒温在25℃。

    10.  终止电泳,取出凝胶进行后续的处理(如银染)(核酸快速银染试剂盒 Cat RTS5101) 。

    常见问题:

    1. 为何 SSCP-PCR带型有复合条带?

    原因之一:可能是残留的 PCR 引物跟单链的 DNA 结合形成迁移率不同的条带。解决方法是稀释PCR或电泳前将PCR产物进行纯化。

    原因之二:可能是PCR产物用量过高,彼此复性。解决办法是将PCR产物稀释后4-8倍后使用。 

    2. 如何提高电泳分辨率?

    可以在配胶时加入甘油(终浓度为5%-10%),因为甘油是弱变性剂,能部分展开 DNA 折叠结构,增加表面积,增加电泳时位移差异。但加入甘油后粘性变大,电泳速度变慢,因此只适合常温电泳使用,不要4℃电泳。如果条件允许,最好同时做加甘油和不加甘油的电泳实验。



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