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碱性蛋白非变性PAGE凝胶制备及电泳试剂盒
 产品货号: RTD6131
 产品名称: 碱性蛋白非变性PAGE凝胶制备及电泳试剂盒
 产品价格/规格: 50次 500元
 产品说明书: 点击查看
 更新时间: 2019-04-30
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  • 碱性蛋白非变性PAGE凝胶制备及电泳试剂盒(货号:RTD6131

    Basic Protein Native PAGE Gel Preparation and Electrophoresis Kit

    产品组成:

    货号

    名称

    规格

    保存条件

    AC2913-01

    30%PAA(29:1)

    100 ml

    4,避光

    RTD6131-02

    4×碱性蛋白分离胶缓冲液 pH4.3

    100 ml

    4

    RTD6131-03

    4×碱性蛋白浓缩胶缓冲液 pH6.8

    30 ml

    4

    RTD6131-04

    100×分离胶促凝剂

    2.5 ml

    -20

    AP020P

    APS(干粉)

    0.5 g

    RT

    TA0761-01

    TEMED

    0.5 ml

    4,避光

    PL110

    甲基绿上样缓冲液

    1 ml

    -20

    TG160P

    碱性蛋白电泳缓冲液(干粉)

    1 L

    RT

    产品简介:

    本公司提供的试剂盒包含碱性蛋白凝胶制备及电泳所需的全部试剂,用户只需自备制胶器具和蒸馏水。本试剂盒可用于配制碱性蛋白非变性(native)PAGE凝胶。本试剂盒可配制30-50块常规大小的非变性PAGE胶。

    各种蛋白质分子由于所含的碱性氨基酸和酸性氨基酸的数目不同,因而有各自的等电点。凡碱性氨基酸含量较多的蛋白质称为碱性蛋白质,等电点偏碱性,如组蛋白、精蛋白?#21462;?#21453;之,凡酸性氨基酸含量较多的蛋白质,等电点就偏酸性。分离碱性蛋白时候,要利用低 pH 凝胶系?#24120;?#20998;离酸性蛋白时候,要利用高 pH 凝胶系统。酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的 pH 是 8.8的缓冲系?#24120;?#34507;白会带负电荷,蛋白会相阳极移动;而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行,蛋白带正电荷,这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。

    特别说明:由于本系统采用非连续凝胶系?#24120;?#20998;离胶pH为4.3,因此要求待分离的蛋白等电点pI>7.0,这样碱性蛋白在酸性凝胶系统内带正电荷,在凝胶电泳中才能正常向阴极泳动。如果待分离的蛋白等电点pI<7.0,请选择非连续Laemmli活性凝胶系统分离(货号:RTD6130)。

    使用说明:

    配制分离胶

    根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度(表一),配制非变性PAGE的分离胶。


    表一 不同浓度的PAGE分离胶的最佳分离范围

    PAGE分离胶浓度

    最佳分离范围

    6%

    50-150kD

    8%

    30-90kD

    10%

    20-80kD

    12%

    12-60kD

    15%

    10-40kD



    配制分离胶前,根据以下配方准备10% APS:

    10% APS配制-5 ml

    将0.5 gAPS干粉溶于5 ml灭菌水中,彻底溶解后分装,1 ml/支,-20℃备存,每次取一管使用。10% APS应尽量减少室温存放时间,以防失效。10%APS在4℃有效期为一周,-20℃有效期6个?#38534;?#33509;发现凝胶聚合时间延长,应考虑更换使用-20度保存的10% APS。

    制备分离胶步骤:

    1.参照凝胶模具说明书,装配好凝胶模具。

    2.根据下表,将不同体积的成分在小烧杯或试管中混合,轻轻搅拌使其混匀,避免产生气泡

    3.在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液(对于mini-gel,凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm?#32431;桑缓?#22312;分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-5 cm的水层,使凝胶表面保?#21046;?#25972;。

    4.静置15-30分钟,待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后,说明凝胶已聚合。

    注:凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度?#32454;?#26102;,聚合较快;冬天气温低时,聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。

    配制不同体积的 8%分离胶所需各组分的体积(毫升)

    凝胶总体积(ml

    5 ml

    10 ml

    15 ml

    20 ml

    30 ml

    组份

    组份加入体积(ml

    灭菌水

    2.4

    4.7

    7.1

    9.5

    14.2

    4×分离胶缓冲液 pH4.3

    1.25

    2.5

    3.75

    5

    7.5

    30 PAA29:1

    1.3

    2.7

    4

    5.3

    8

    100×分离胶促凝剂

    0.05

    0.1

    0.15

    0.2

    0.3

    10 APS

    0.05

    0.1

    0.15

    0.2

    0.3

    TEMED

    0.005

    0.01

    0.015

    0.02

    0.03

    配制不同体积的 10%分离胶所需各组分的体积(毫升)

    凝胶总体积(ml

    5

    10

    15

    20

    30

    组份

    组份加入体积(ml

    灭菌水

    2

    4.1

    6.1

    8.1

    12.2

    4×分离胶缓冲液 pH4.3

    1.25

    2.5

    3.75

    5

    7.5

    30 PAA29:1

    1.7

    3.3

    5

    6.7

    10

    100×分离胶促凝剂

    0.05

    0.1

    0.15

    0.2

    0.3

    10 APS

    0.05

    0.1

    0.15

    0.2

    0.3

    TEMED

    0.005

    0.01

    0.015

    0.02

    0.03

    配制不同体积的 12%分离胶所需各组分的体积(毫升)

    凝胶总体积(ml

    5

    10

    15

    20

    30

    组份

    组份加入体积(ml

    灭菌水

    1.7

    3.4

    5.1

    6.8

    10.2

    4×分离胶缓冲液 pH4.3

    1.25

    2.5

    3.75

    5

    7.5

    30 PAA29:1

    2

    4

    6

    8

    12

    100×分离胶促凝剂

    0.05

    0.1

    0.15

    0.2

    0.3

    10 APS

    0.05

    0.1

    0.15

    0.2

    0.3

    TEMED

    0.005

    0.01

    0.015

    0.02

    0.03

    配制不同体积的 15%分离胶所需各组分的体积(毫升)

     

    凝胶总体积(ml

    5 ml

    10 ml

    15 ml

    20 ml

    30 ml

    组份

    组份加入体积(ml

    灭菌水

    1.2

    2.4

    3.6

    4.8

    7.2

    4×分离胶缓冲液 pH4.3

    1.25

    2.5

    3.75

    5

    7.5

    30 PAA29:1

    2.5

    5.0

    7.5

    10

    15

    100×分离胶促凝剂

    0.05

    0.1

    0.15

    0.2

    0.3

    10 APS

    0.05

    0.1

    0.15

    0.2

    0.3

    TEMED

    0.005

    0.01

    0.015

    0.02

    0.03

    浓缩胶制备:

    1.去除覆盖在分离胶?#31995;?#27700;层。

    2.按照表三将不同成分在一个小烧杯或试管中混合,轻轻搅拌使其混匀,避免产生气泡。

    3.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面,直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。

    4.将梳子插入凝胶内,避免产生气泡。

    5.静置30-60分钟,等待浓缩胶聚合。

    注:凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度?#32454;?#26102;,聚合较快;冬天气温低时,聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。

    表三 碱性蛋白Native PAGE浓缩胶(5%)配方表

    组份

    不同凝胶体积?#26434;?#21508;组份的取样量(ml

    2 ml

    4 ml

    6 ml

    10 ml

    H2O

    1.15

    2.3

    3.4

    5.7

    4×碱性蛋白浓缩胶缓冲液 pH6.8

    0.5

    1

    1.5

    2.5

    30 PAA29:1

    0.33

    0.67

    1

    1.7

    TEMED

    0.002

    0.004

    0.006

    0.01

    10 APS

    0.02

    0.04

    0.06

    0.1

    电泳:

    凝胶凝固好后,根据以下配方准备电泳缓冲液。

    碱性蛋白电泳缓冲液的配制-1 L:将5×碱性蛋白电泳缓冲液干粉全部倒入1L烧杯中,加入约900 ml水彻底溶解,加入冰醋酸11ml,用水定容至1 L,?#30913;?#25104;5×碱性蛋白电泳缓冲液(此溶液pH值约为4.4)。

    将5×碱性蛋白电泳缓冲液稀释5倍?#30913;?#25104;1×碱性蛋白电泳缓冲液。在电泳槽的内槽内加入1×碱性蛋白电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔),轻轻的拨出梳子,冲洗加样孔,随后在电泳槽外槽加入适量的1×碱性蛋白电泳缓冲液。上样,把电泳电源的电源线互换,即红色的阳极电极查到阴极孔,黑色的阴极电极插到阳极孔,按照表四条件,电泳,等指示前沿甲基绿电泳到分离胶下缘后,结束电泳,染色或者进行下一步实验。     表四 碱性蛋白电泳条件

    恒电压

    150V

    起始电流

    30-40mA/板胶

    结束电流

    10-20mA/板胶

    电泳时间

    40-45分钟


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